高存活率細胞凍存液

CryoScarless^® DMSO-Free

CryoScarless^® DMSO-Free 是一款不含蛋白和 DMSO，適用于多種細胞的細胞凍存液。各種細胞在解凍后具有很高的培養(yǎng)活率，且維持了干細胞的多分化性（未分化狀態(tài)）。

◆關于含有DMSO凍存液的問題

DMSO作為普通細胞冷凍保護成分常被添加到凍存液中，但同時也是對人體有害的成分，且極易被皮膚吸收。除具有細胞毒性外，如同下列論文所述，是影響細胞分化的因子之一。因此，為獲得更精確的實驗結(jié)果，無DMSO的細胞保存是必須的。

● 使用DMSO將人骨髓白血病細胞株 HL-60 分化為粒細胞。¹

● 使用DMSO將小鼠間充質(zhì)干細胞分化為心肌細胞。 ²

● 使用含有DMSD的凍存液凍存人ES細胞發(fā)現(xiàn)未分化標記Oct-4的表達降低。 ³

參考文獻

1. Jiang, G., et al., Int. Immunopharmacol., 6 (7), 1204～1213 (2006).

2. Young, D. A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 322 (3), 759～765 (2004).

3. Katkov, I. I., et al., Cryobiology, 53 (2), 194～205 (2006).

◆特點

● 不含血清和蛋白，因此不受白蛋白和球蛋白等蛋白的影響。

● 不受DMSO毒性和蛋白影響，可安全且高活率地凍存細胞。

● 大部分細胞在凍存后復蘇，存活率可達90%以上。

● 已有人/小鼠的正常細胞、腫瘤細胞株、干細胞等各種細胞的凍存應用。

● 凍存后可維持干細胞的分化性能。

● 同樣適用于無血清培養(yǎng)。

● 經(jīng)無菌測試確認不含細菌、真菌與支原體污染。

● 本產(chǎn)品可在４°C下長期保存。（有效期２年）。 

※　使用臺盼藍處理CryoScarless保存的細胞時，請務必清洗細胞。

◆應用實例１

大鼠間充質(zhì)干細胞分化能力

確認使用本產(chǎn)品凍存的大鼠間充質(zhì)干細胞在復蘇后的分化能力，并與未凍存組以及10% DMSO保存的細胞進行比較。結(jié)果顯示，使用本產(chǎn)品凍存的細胞皆維持良好的分化性能。

大鼠間充干細胞的存活率

檢測使用本產(chǎn)品凍存（１周）的大鼠間充質(zhì)干細胞在復蘇后的存活率以及 6 h后的存活率，并與10% DMSO保存的情況進行比較。本產(chǎn)品無論是在剛復蘇（0 h），還是貼壁后（6 h）皆顯示更高的存活率。

◆應用實例2

使用 CryoScarless^® DMSO-Free 簡單凍存后的小鼠 ES 細胞

實驗方法：

將小鼠 ES 細胞（FKHR＋/＋）在明膠包被的96孔板上于37°C培養(yǎng)48 h后，進行簡單地凍存。吸走培養(yǎng)基并用PBS清洗，然后分別添加10%DMSO/培養(yǎng)基，或CryoScarless^® DMSO-Free，在-80°C下保存。24 h后迅速復蘇，添加加熱至37°C的培養(yǎng)基，在37°C下繼續(xù)培養(yǎng)。6 h后使用光學顯微鏡觀察相襯圖像。

結(jié)果：

可觀察到在10%DMSO/培養(yǎng)基中保存的小鼠ES細胞在復蘇后活細胞減少（左圖），而在 CryoScarless^® DMSO-Free 中保存的小鼠ES細胞狀態(tài)得到改善，可觀察到大部分的活細胞。

討論：

在對多個轉(zhuǎn)基因克隆的培養(yǎng)板一起進行凍存時（簡易凍存），使用CryoScarless^® DMSO-Free 更加方便。利用 CryoScarless^® DMSO-Free 進行凍存，存活細胞更多，更易于未分化小鼠ES細胞的傳代培養(yǎng)（在一定細胞密度下每２天傳代一次），并可順利進行分化實驗。

數(shù)據(jù)提供

熊本大學發(fā)育醫(yī)學研究所 干細胞部門 組織干細胞領域 田村潔美老師

小川峰太郎老師（組織干細胞領域教授：中間），田村潔美老師（右起2）與研究室成員

◆應用實例３

對于人牙髓來源間充質(zhì)干細胞的體內(nèi)實驗，CryoScarless^® DMSO-Free 擁有更出色的凍存能力

日本牙科大學生命牙學部 發(fā)育、再生醫(yī)科講座 中原貴教授

生命牙科學講座 望月 真衣 助教

Establishment of xenogeneic serum-free culture methods for handling human dental pulp stem cells using clinically oriented in-vitro and in-vivo conditions.

Stem Cell Research & Therapy,, 9：25, (2015).

背景

由于再生醫(yī)學不斷普及，因此急需確立可安全地培養(yǎng)從患者獲得的間充質(zhì)干細胞的方法。近年來，通過牙科治療從拔牙的牙組織（牙髓）中獲得的間充質(zhì)干細胞，顯示比骨髓干細胞高3~4倍的高增殖性，且沒有伴隨染色體異常的細胞變化。而且牙髓干細胞擁有與骨髓干細胞相同的多分化性能。由于在體外培養(yǎng)可大量增殖，靈活利用低癌變和成瘤風險的牙髓干細胞，對于確保醫(yī)療安全性的再生醫(yī)學來說是一個ji具吸引力的選擇。

作為再生醫(yī)學中bi不可少的"細胞凍存"，已經(jīng)證明CryoScarless^® DMSO-Free（BioVerde公司）是一款優(yōu)秀的細胞凍存液。換言之，使用該細胞凍存液凍存的人牙髓干細胞擁有與未經(jīng)凍存培養(yǎng)的牙髓干細胞相同的增殖能與多分化能力，且未發(fā)現(xiàn)染色體異常。

本文著眼于牙髓干細胞活躍的增殖能力，并證實了CryoScarless^® DMSO-Free不會影響細胞增殖能力。

方法及結(jié)果

從20~37歲成人拔下來的智齒分離牙髓細胞并進行無血清培養(yǎng)，培養(yǎng)至傳代數(shù)為1時使用CryoScarless^® DMSO-Free凍存。3個月后再次培養(yǎng)凍存的細胞，傳代數(shù)到3時進行以下的細胞評價。同時，對未經(jīng)凍存的牙髓細胞也進行了相同的評價。

使用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，確認紡錘形的成纖維細胞形態(tài)沒有發(fā)生變化（圖-1）。根據(jù)增殖曲線分析的結(jié)果，經(jīng)過12天的培養(yǎng)，呈現(xiàn)一致的細胞增殖模式，兩者間在統(tǒng)計學上的沒有顯著差異（圖-2）。另外，通過Bromodeoxyuridine（BrdU）進行細胞分裂能力分析的結(jié)果顯示，可觀察到對數(shù)生長期內(nèi)大量的BrdU陽性細胞，細胞數(shù)在統(tǒng)計學上沒有顯著差異（圖-3）。

圖-1 人牙髓干細胞的相差顯微鏡圖像

無論CryoScarless^® DMSO-Free凍存（左）還是未經(jīng)凍存（右）的細胞都呈現(xiàn)出相同的成纖維細胞樣形態(tài)。

圖-2 人牙髓干細胞增殖曲線分析

細胞培養(yǎng)期間，未發(fā)現(xiàn)兩者在統(tǒng)計學上的顯著差異。

圖-3 人牙髓干細胞在對數(shù)生長期內(nèi)的BrdU分析

可觀察到大部分細胞攝入BraU（綠）（左），未發(fā)現(xiàn)兩者的BraU陽性細胞數(shù)在統(tǒng)計學上的顯著差異（右）。

結(jié)論

除了本文中報告的細胞增殖能力評價之外，使用CryoScarless^® DMSO-Free凍存的牙髓干細胞不僅維持了成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞的多分化能力，也能維持向免疫缺陷小鼠的皮下移植并引起硬組織形成的能力。并且該產(chǎn)品并不影響干細胞的特性。

另外，值得注意的是，使用CryoScarless^® DMSO-Free凍存的牙髓干細胞即使長期培養(yǎng)至傳代數(shù)為10后仍然保持染色體的二倍體和正常核型，大量培養(yǎng)的細胞中也沒有發(fā)現(xiàn)染色體異常。

在再生醫(yī)學中bi不可少的"細胞凍存"中，作為冷凍保護劑使用的Dimethyl sulfoxide（DMSO）可能會有細胞毒性和引起意外的細胞分化，因此，我們十分期待能夠確立一個像該產(chǎn)品一樣的無DMSO的細胞凍存體系。

本報道中使用易于獲得的牙髓來源間充質(zhì)干細胞，研究了CryoScarless^® DMSO-Free對干細胞特性的影響，并確認了使用該產(chǎn)品凍存的細胞與未經(jīng)凍存的牙髓干細胞擁有相同的細胞特性。因此，CryoScarless^® DMSO-Free在間充質(zhì)干細胞基礎研究以及臨床前研究，甚至是將來的再生醫(yī)學領域中，有望成為一款可以提供安全且高預測性數(shù)據(jù)和治療成果的細胞凍存液。

中原貴教授（前排右），望月真衣助教（前排左）與研究室成員

◆實際應用的細胞和凍存效果

* -80°C凍存3個月，復蘇后24 h

◆操作方法概要

1. 將培養(yǎng)細胞放入離心管，離心并去掉上清。

2. 按照5×10⁵～5×10⁶ cells/mL添加本產(chǎn)品，并制成細胞懸液，每個凍存管分裝1 mL。

3. 放入－80℃超低溫冰箱中凍存。

4. 將在上一步中保存的細胞放入37°C恒溫水浴槽中，快速晃動使細胞解凍，融化后放入適當?shù)呐囵B(yǎng)基（10 mL）中并離心清洗。

※長期保存請置于液氮罐中保存。