未分化人ES/iPS細(xì)胞檢測(cè)試劑

僅需添加培養(yǎng)液便可檢出人ES/iPS細(xì)胞！

熒光標(biāo)記 rBC2LCN（AiLecS1）

◆rBC2LCN（AiLecS1）

　　rBC2LCN（AiLecS1）是在伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cenocepacia）來(lái)源凝集素 BC2L-C 的 N末端域表達(dá)的重組凝集素。

　　由于 rBC2LCN 對(duì)存在于人ES/iPS細(xì)胞表面的足糖萼蛋白（Podocalyxin）上的粘蛋白樣O-型糖鏈的H型3（Fucα1-2Galβ1-3GalNAc）具有高親和力，因此可用作人 ES/iPS 細(xì)胞的未分化標(biāo)志物。

　　本產(chǎn)品是熒光染色標(biāo)記，能直接添加到人 ES/iPS 細(xì)胞的培養(yǎng)液中，實(shí)現(xiàn)未分化活細(xì)胞分析。 適用于未分化細(xì)胞檢測(cè)用標(biāo)記。可用于細(xì)胞染色，流式細(xì)胞儀。另外，使用本品持續(xù)培養(yǎng)數(shù)日已確認(rèn)細(xì)胞無(wú)毒性。

　　我們供應(yīng)綠色熒光標(biāo)記（FITC），黃色熒光標(biāo)記（Cy3），紅色熒光標(biāo)記（Cy5）的三種類型的系列商品。

◆特點(diǎn)

●　添加到培養(yǎng)基即可進(jìn)行染色

●　無(wú)需固定細(xì)胞，活細(xì)胞也可直接進(jìn)行明顯染色

●　細(xì)胞毒性低，染色后也可培養(yǎng)

●　識(shí)別 Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-3, SSEA-4 細(xì)胞表面存在的糖鏈

●　可用于細(xì)胞染色和流式細(xì)胞儀

◆產(chǎn)品概述

●　已進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)（0.1 μm 過(guò)濾器進(jìn)行滅菌）

●　PBS(-) 溶液

●　使用時(shí)稀釋比

　  Live Cell Imaging 1：100～1,000
　  Flow Cytometry 1：100～1,000

●　激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)

◆使用方法

細(xì)胞染色

活細(xì)胞染色（Live Cell Imaging）

1. 準(zhǔn)備培養(yǎng)中的人 ES/iPS 細(xì)胞

2. 每 1 mL 的培養(yǎng)基添加 1~10 μL 的熒光標(biāo)記 rBC2LCN

3. 37℃，5％CO₂ 孵育 30 分鐘。

4. 更換新的培養(yǎng)基或者 HBSS(+)。

5. 利用熒光顯微鏡觀察

固定細(xì)胞染色

1. 準(zhǔn)備培養(yǎng)中的人 ES/iPS 細(xì)胞

2. 除去培養(yǎng)基，用 HBSS(+) 洗凈。

3. 添加 4%多聚甲醛（PFA）溶液，室溫靜置 10～20 分鐘。

4. 除去 PFA 后，用 D-PBS(-) 洗凈三次。

5. 添加 D-PBS(-)。

6. 每 1 mL 的 D-PBS(-) 添加 1～10 μL 熒光標(biāo)記 rBC2LCN。

7. 37℃，5% CO₂ 孵育 30 分鐘。

8. 更換 D-PBS(-)。

9. 利用熒光顯微鏡觀察。

流式細(xì)胞儀

1. 準(zhǔn)備培養(yǎng)中的人 ES/iPS 細(xì)胞。

2. 使用細(xì)胞分散液，分散成單細(xì)胞。

3. 將細(xì)胞分散液移至管內(nèi)，1,000 rpm 離心 3 分鐘。

4. 除去上清液，用 FCM Buffer* 重懸細(xì)胞，離心后，舍棄上清液。

* FCM Buffer： D-PBS(-)和HBSS(-)含有 10 mmol/L EDTA，1% BSA

5. 用 FCM Buffer 重懸出 5×10⁶ cells/mL 的細(xì)胞懸浮液

6. 每 1 mL 細(xì)胞懸浮液，添加 1～10 μL 的熒光標(biāo)記 rBC2LCN。

7. 室溫，避光靜置30分鐘。

8. 1,000 rpm 離心三分鐘，除去上清液。

9. 用 FCM Buffer 重懸細(xì)胞，離心后，除去上清液。

10.  適量的 FCM Buffer 再懸浮細(xì)胞。

11.  進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。

使用注意

1. rBC2LCN 染色可以維持 2~3天。

2. 使用含有血清的培養(yǎng)基可能使信號(hào)背景變高

3. 根據(jù)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選時(shí)，當(dāng)細(xì)胞分散或 FCM 緩沖液的終濃度到達(dá) 10 μmol/L 時(shí)，請(qǐng)?zhí)砑?Y-27632。

◆人iPS細(xì)胞的活細(xì)胞染色（Live Cell Imaging）

●　用 rBC2LCN-FITC， rBC2LCN-635 以及 Hoechst33342 對(duì)人 iPS 細(xì)胞 201B7 株進(jìn)行染色處理。（無(wú)細(xì)胞固定）

（稀釋倍數(shù)　1：1,000）

●　用 rBC2LCN-FITC、Tra-1-60、Tra-1-81、SSEA-4 對(duì)人 iPS 細(xì)胞 201B7 株進(jìn)行染色處理。

　  2小時(shí)后確認(rèn)染色圖像。（未固定細(xì)胞）

（稀釋倍數(shù)　1：100）       

★　與 Tra-1-60、Tra-1-81 相比較，rBC2LCN 的活細(xì)胞染色度更強(qiáng)。

★　即使交換培養(yǎng)基，rBC2LCN 染色第二天后染色效果依然明顯。

◆人ES細(xì)胞的活細(xì)胞染色（Live Cell Imaging）

　　使用 rBC2LCN-FITC 對(duì)人 ES 細(xì)胞 WA01 株進(jìn)行染色（未細(xì)胞固定）。細(xì)胞的一部分無(wú)法維持未分化狀態(tài)而進(jìn)行分化。如果使用 rBC2LCN-FITC 對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色，以維持未分化狀態(tài)部分已染色，而已分化部分未染色來(lái)進(jìn)行區(qū)分。

＜數(shù)據(jù)提供 國(guó)家研究與發(fā)展公司優(yōu)良工業(yè)科學(xué)和技術(shù)研究院 新藥開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)研究部門(mén)恭子小沼老師，伊藤弦老師＞

◆人 iPS 細(xì)胞固定后染色

　　將人 iPS 細(xì)胞 201B7 株用多聚甲醛固定后，使用 rBC2LCN 和 DAPI 進(jìn)行細(xì)胞染色。

對(duì)于人 iPS 細(xì)胞毒性評(píng)估

　　向人 iPS 細(xì)胞 201B7 株的培養(yǎng)液中分別添加其 1/1,000、1/100、1/50 量的 rBC2LCN-FITC，持續(xù)培養(yǎng)。其結(jié)果是，不存在 rBC2LCN-FITC 濃度對(duì)毒性影響，不同濃度的細(xì)胞增殖程度相同程度。

〔細(xì)胞株〕
　人iPS細(xì)胞 201B7株

〔培養(yǎng)基組成〕
　StemSure^® hPSC培養(yǎng)基Δ+35 ng/mL bFGF

〔涂層〕
　Matrigel^® hESC-Qualified Matrix

〔細(xì)胞接種數(shù)目〕
　4×10⁴ cells/well（12孔板）

　使用Flow Cytometry進(jìn)行人iPS細(xì)胞分離

　使用rBC2LCN-FITC及rBC2LCN-6547、rBC2LCN-635對(duì)人iPS細(xì)胞201B7細(xì)胞株和人正常二倍體成纖維細(xì)胞染色，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。

　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：未分化的人iPS細(xì)胞與分化的人二倍體成纖維細(xì)胞成功分離。

◆產(chǎn)品列表