蛋白聚集小體檢測(cè)試劑盒

PROTEOSTAT^® Aggresome detection kit

◆原理

聚集小體（Aggresome）是由一群不正常堆疊在一起的蛋白質(zhì)所形成的包涵體（Inclusion Bodies）。聚集小體的出現(xiàn)往往也表明細(xì)胞正處于某種應(yīng)激狀態(tài)，比如高溫、病毒感染、活性氧自由基攻擊等。聚集體通常是響應(yīng)細(xì)胞應(yīng)激而形成，并通過(guò)分離錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)提供細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，最終導(dǎo)致它們被自噬清除。此外，蛋白質(zhì)聚集體的形成是多種人類疾病的標(biāo)志，例如阿爾茨海默氏癥、帕金森氏癥、肌weisuo側(cè)索硬化癥或酒精性肝病。

PROTEOSTAT^® Aggresome detection kit中包含的 PROTEOSTAT^® 是一種分子轉(zhuǎn)子染料，在溶液中沿著單個(gè)中心鍵的自由分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)可防止熒光產(chǎn)生。當(dāng)它特異地插入到錯(cuò)誤折疊和聚集的蛋白中的交叉β-sheet四級(jí)結(jié)構(gòu)中，旋轉(zhuǎn)受到抑制并導(dǎo)致發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。

PROTEOSTAT^® 聚集小體檢測(cè)試劑盒提供了一種快速、特異、定量的方法來(lái)標(biāo)記細(xì)胞中的聚集小體，且無(wú)需進(jìn)行人工蛋白定點(diǎn)突變。PROTEOSTAT^® 染料已在廣泛的條件下對(duì)多種小分子調(diào)節(jié)劑進(jìn)行驗(yàn)證，適用于具有治療價(jià)值的化學(xué)物的篩選。此外，本試劑盒還適用于多重免疫熒光，以在自噬和聚集體形成的背景下研究您的目標(biāo)分子。

◆試劑盒組成

 ◆特點(diǎn)

●　提供基于細(xì)胞的靈敏的藥物反應(yīng)性測(cè)定，以在真實(shí)的細(xì)胞環(huán)境中識(shí)別與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的抑制劑

●　可靠且簡(jiǎn)單的檢測(cè)，不需要非生理性蛋白質(zhì)突變或基因工程細(xì)胞系

●　作用條件廣泛，適用于篩選具有潛在治療價(jià)值的小分子化合物

●　已進(jìn)行優(yōu)化以兼容免疫染色

●　可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)輕松量化聚集體和相關(guān)包涵體

●　可用于神經(jīng)退行性疾病、肝病、毒理學(xué)研究等的研究 

 ◆案例?應(yīng)用

■　應(yīng)用實(shí)例 1：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)聚集小體

流式細(xì)胞術(shù)的分析：Jurkat細(xì)胞在37°C下用 0.2% DMSO對(duì)照或用5 µM MG-132誘導(dǎo)過(guò)夜。處理后，將細(xì)胞固定并與PROTEOSTAT^® 染料一起孵育，無(wú)需洗滌即通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)在FL3通道中使用488 nm激光進(jìn)行分析。在 MG-132處理的細(xì)胞中，紅色熒光信號(hào)增加約3倍。所描述的測(cè)定允許評(píng)估蛋白質(zhì)聚集的影響。

■　應(yīng)用實(shí)例 2：PROTEOSTAT^® 染料與熒光染料的應(yīng)用

熒光顯微鏡：含有蛋白聚集體的HeLa細(xì)胞，用 5 µM MG-132蛋白酶體抑制劑（右）處理12小時(shí)，通過(guò) PROTEOSTAT^®（紅色）檢測(cè)并用Hoechst 33342復(fù)染。左側(cè)的為未經(jīng)處理的對(duì)照。

熒光顯微鏡：含有蛋白聚集體的HeLa細(xì)胞，用 5μM MG-132蛋白酶體抑制劑處理12小時(shí)，通過(guò)PROTEOSTAT^®聚集體染料（左上）檢測(cè)，顯示與熒光素-p62抗體（右上）和復(fù)合圖像（中下）的共定位

■　應(yīng)用實(shí)例 3：不同攪拌速率對(duì)蛋白聚集的影響

使用本產(chǎn)品檢測(cè)后，可知攪拌速度越快，蛋白聚集程度越大。

■　應(yīng)用實(shí)例 4：蛋氨酸氧化可抑制蛋白聚集

藍(lán)色曲線為對(duì)照，沒有攪拌；在攪拌速度在300 rpm下， 綠色曲線與紅色曲線分別表示蛋氨酸被氧化后的蛋白聚集情況。

使用本產(chǎn)品檢測(cè)后，可知蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集。

■　應(yīng)用實(shí)例 5 ：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞自噬產(chǎn)生蛋白聚集小體

分別25，50，75 mmCQ，100 nM的thapsigargin（TG）或5mM的MG-132處理K562細(xì)胞24小時(shí)。然后在溫室下用PROTEOSTAT® （1：10,000）固定并透化細(xì)胞30min。接著在BD流式細(xì)胞儀LSR II的藍(lán)色610/20 nm的通道分析細(xì)胞（30,000）。

圖片來(lái)源：Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK.

■　應(yīng)用實(shí)例 6

K562 細(xì)胞分別使用Thapsigargin (Tg, 0.1 µM)、25、50 和 75 µM lvkui (CQ) 用試劑處理以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和不wanquan自噬 24 h。使用蛋白酶體抑制劑 MG-132 (5 µM) 作為陽(yáng)性對(duì)照處理24 h。將沉淀的細(xì)胞固定并透化。然后，根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用 300 µL PROTEOSTAT^® 和 1 µg/mL DAPI（用于細(xì)胞周期測(cè)定）在室溫下標(biāo)記細(xì)胞30min。確定每個(gè)處理的S期的 Aggresome 傾向因子 (APF) 高于G1和高于S期的G2m的相對(duì)增加，并與對(duì)照值進(jìn)行比較。與對(duì)照組相比，ER 應(yīng)激誘導(dǎo)劑、Tg 和 50 µM CQ在S期比G1更能引起蛋白聚集體上調(diào)，但蛋白酶體抑制劑 MG-132 和 50 µM CQ 在 G2m 期比S期更顯著地下調(diào)聚集體。

圖片來(lái)源：Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK.