可實現(xiàn)局部組織結(jié)構(gòu)可視化的熒光染料

HistoBright

HistoBright是一種可實現(xiàn)雙光子激發(fā)的環(huán)境響應(yīng)型膜染色熒光色素，組織滲透性優(yōu)異，可根據(jù)組織的局部結(jié)構(gòu)改變熒光特性，因此可實現(xiàn)高對比度的組織可視化。結(jié)合組織透明化處理和雙光子激光顯微鏡使用，可對組織塊進行深度觀察和空間結(jié)構(gòu)分析。

※ 本產(chǎn)品基于高知大學(xué)和愛媛大學(xué)的研究成果，由funakoshi（株）生產(chǎn)并銷售。

※ 本產(chǎn)品僅供研究使用，研究以外的目的不可使用。

HistoBright 是一種環(huán)境響應(yīng)型熒光染料，可根據(jù)溶劑的極性顯示出大范圍的波長。應(yīng)用于透明化處理后的組織時，熒光會響應(yīng)組織內(nèi)的微環(huán)境而發(fā)生變化，隨后配合雙光子激光顯微鏡即可清晰地觀察到組織結(jié)構(gòu)。

◆傳統(tǒng)的組織結(jié)構(gòu)分析方法和新型的三維組織結(jié)構(gòu)分析

傳統(tǒng)的組織結(jié)構(gòu)分析，是通過有色染料對組織進行染色實現(xiàn)的，如蘇木精-伊紅（HE）染色法。而使用這些有色染料很難將組織塊整塊染色，一般需制成薄切片后再進行觀察。但薄切片很容易丟失組織結(jié)構(gòu)的三維信息，因此需要制備大量切片才能重現(xiàn)三維結(jié)構(gòu)。

HistoBright是高知大學(xué)教育研究部的仁子陽輔博士合成的新型環(huán)境響應(yīng)型熒光染料（原著論文中的化合物名為PC），目前由愛媛大學(xué)醫(yī)學(xué)部的今村健志博士、村上正基博士、川上良介博士推進開發(fā)應(yīng)用于三維組織結(jié)構(gòu)的熒光成像染料。HistoBright會聚集在生物膜上，并根據(jù)所在局部環(huán)境不同，熒光在綠光~近紅外光的大范圍內(nèi)變化。因此，當HistoBright應(yīng)用于生物組織時，它可以根據(jù)組織結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)熒光色調(diào)的變化，從而實現(xiàn)高對比度觀察組織結(jié)構(gòu)。由于HistoBright能夠進行雙光子激發(fā)，因此除了激光共聚焦顯微鏡外，還可以使用雙光子激光顯微鏡進行觀察。此外，配合組織透明化處理（除保持膜結(jié)構(gòu)進行脫脂操作的方法外），使用HistoBright可在不破壞組織結(jié)構(gòu)（不制備薄切片）的前提下觀察厚組織樣本，并通過雙光子激光顯微鏡進行深度成像，實現(xiàn)組織的三維結(jié)構(gòu)分析。

◆特點

● 環(huán)境響應(yīng)型的膜染色試劑，能根據(jù)周圍環(huán)境表現(xiàn)出綠光~近紅外光的熒光特性。通過區(qū)分需要檢測的熒光波長范圍，可實現(xiàn)高對比度的局部組織結(jié)

　構(gòu)可視化。

● 配合無脫脂處理的組織透明化處理（如RapiClear（SunJin Lab公司）、LUCID等），可實現(xiàn)深度的組織結(jié)構(gòu)三維分析。

● ※ 使用表面活性劑（Triton X-100、Tween 20等）會溶解組織中的脂質(zhì)膜，可能對HistoBright的染色產(chǎn)生影響，因此不推薦使用。如需使用，請討論適用條件。

● 使用激光共聚焦顯微鏡鏡（推薦激發(fā)光：488 nm激光）或雙光子激光顯微鏡（推薦激發(fā)光：960 nm激光）皆可進行觀察。

● 使用雙光子激光顯微鏡觀察時，可配合使用二次諧波發(fā)生（SHG）成像，在使用本試劑的同時觀察未染色組織中的膠原纖維。

● 使用HistoBright進行染色和觀察后，可進行HE染色。

◆原著原文

Inoue, K., et al., J. Mater. Chem. B., 10(10), 1641～1649 (2022). Synthesis and photophysical properties of a new push-pull pyrene dye with green-to-far-red emission and its application to human cellular and skin tissue imaging. [PMID：35194628]

◆原理

激發(fā)/發(fā)射光譜

HistoBright是一種根據(jù)溶劑的分子極性改變熒光特性的溶劑極性響應(yīng)型熒光染料（Solvatochromic fluorescent dye）。根據(jù)溶劑的極性，熒光會從綠色（低極性）向近紅外光（高極性）的范圍內(nèi)大幅變動。

脂質(zhì)體膜模型中熒光光譜的變化

HistoBright對脂質(zhì)膜顯示高親和性，并根據(jù)脂質(zhì)膜的相態(tài)表現(xiàn)出不同的熒光特性。與有序相Lo模型（鞘磷脂（SM）/danguchun（Chol））脂質(zhì)體中的熒光最大值不同，無序相Ld模型（DOPC）脂質(zhì)體中的最大波長也轉(zhuǎn)移到了約30 nm的長波長范圍，熒光量子產(chǎn)率也從0.72（SM/Chol）下降到了0.37（DOPC）。

※ 以上熒光光譜數(shù)據(jù)均由高知大學(xué) 仁子陽輔博士提供。

◆應(yīng)用數(shù)據(jù)

使用雙光子激光顯微鏡對透明化人正常皮膚組織進行成像

使用4% paraformaldehyde/ PBS固定人正常皮膚組織塊后，制備成500 μm的切片，同時進行76 h的組織透明化處理（LUCID）和HistoBright（10 μM）染色。通過雙光子激光顯微鏡，用960 nm處激光激發(fā)組織塊，分別在492 nm（SHG：青色）、500-550 nm（綠色）、560~593nm（橙色）和 593-690 nm（紅色）處分別獲取熒光圖像，制作以下4幅合成圖像。

※ 492 nm（青色）來源于組織中膠原纖維的SHG信號，而非HistoBright來源的熒光信號。

接下來，使用雙光子激光顯微鏡在Z軸方向以5 μm的間隔連續(xù)拍攝500 μm的圖像，并使用圖像分析軟件進行三維構(gòu)建，以三維方式將人皮膚組織的精細結(jié)構(gòu)可視化。

使用雙光子激光顯微鏡對透明化人正常皮膚組織進行三維成像

使用4% paraformaldehyde/PBS固定人正常皮膚組織塊后，制備成1 mm的切片，同時進行72 h的組織透明化處理（RapiClear、SunJin Lab公司）＊、HistoBright（10 μM）染色和核染色（Hoechst33342）。通過雙光子激光顯微鏡，用1100 nm處激光激發(fā)組織塊，分別在＜492 nm（SHG：青色）、500~550 nm（綠色）、560~593 nm（橙色）和 593-690 nm（紅色）處分別獲取熒光圖像，制作以下4幅合成圖像。基于以上條件，在Z軸方向以5 μm的間隔連續(xù)拍攝，使用圖像分析軟件進行三維構(gòu)建，將連續(xù)的數(shù)據(jù)制作成動畫。

＊ 本實驗中的組織塊固定后未進行透膜處理，直接透明化處理和染色。

重復(fù)用于HE染色

使用HistoBright染色并觀察人正常皮膚細胞組織塊，在PBS中靜置，去除透明化試劑。然后制備成薄切片，進行HE染色。已確認HistoBright染色后，仍可進行清晰的HE染色。

在激光共聚焦顯微鏡和雙光子激光顯微鏡下觀察染色

使用4% paraformaldehyde/ PBS固定人正常皮膚組織塊后，制備成0.5 mm的切片，同時進行72 h的組織透明化處理（RapiClear、SunJin Lab公司）＊和HistoBright（10 μM）染色。隨后，使用激光共聚焦顯微鏡鏡（左圖：激發(fā)光488 nm激光）和雙光子激光顯微鏡（右圖：激發(fā)光960 nm激光）進行觀察。雖然兩幅圖像沒有明顯區(qū)別，但在雙光子激光顯微鏡下可以觀察到雙光子激發(fā)SHG信號（膠原纖維）。

＊ 本實驗中的組織塊固定后未進行透膜處理，直接透明化處理和染色。

※ 以上圖像數(shù)據(jù)均由愛媛大學(xué) 川上良介博士提供。